GB 4789.3-2025 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数 

中华人民共和国国家标准

GB 4789.3—2025

食品安全国家标准

食品微生物学检验  大肠菌群计数

2025-03-16 发布                                                                                     2025-09-16 实施

中华人民共和国国家卫生健康委员会

国 家 市 场 监 督 管 理 总 局发布

 

前 言

本标准代替GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》。

本标准与GB 4789.3—2016相比,主要变化如下:

—删除了检验原理;

—修改了术语和定义;

—修改了设备和材料、培养基和试剂;

—修改了检验程序、操作步骤、结果与报告和附录。

 

1   范围

本标准规定了食品中大肠菌群(Coliforms)计数的方法。

本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数,第二法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。

2   术语和定义

2.1   大肠菌群coliforms

在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

2.2  MPN法mostprobablenumber(MPN)technique

统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最可能数。

3   设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下。

3.1   恒温培养箱 :36℃ ±1 ℃ 、30 ℃ ±1 ℃ 。

3.2   冰箱 :2 ℃ ~ 8 ℃ 。

3.3   恒温装置 :48 ℃ ±2 ℃ 。

3.4   天平:感量0.1 g。

3.5   均质器及无菌均质袋 、均质杯 ,振荡器 。

3.6   试管 :15 mm×150 mm、18mm×180 mm 或其他合适规格 , 以及小倒管(杜氏管) 或其他合适的产气收集装置 。

3.7   无菌吸管:1 mL(具0.01mL刻度)、2 mL(具0.02mL刻度)、5 mL(具0.05mL刻度)、10mL(具0.1 mL刻度)或微量移液器及无菌吸头。

3.8   无菌锥形瓶 :容量 500 mL。

3.9   无菌培养皿 :直径 90 mm。

3.10   pH 计或精密 pH 试纸 。

3.11   无菌接种环 :10 μL(直径约 3 mm) 。

3.12   放大镜或菌落计数器 。

4   培养基和试剂

4.1   磷酸盐缓冲液 :见附录 A 中 A. 1。

4.2   生理盐水 :见 A. 2。

4.3   月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST) 肉汤 :见 A. 3。

4.4   煌绿乳糖胆盐(BGLB) 肉汤 :见 A. 4。

4.5   结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA) :见 A. 5。

4.6   1 mol/L NaOH :见 A. 6。

4.7   1 mol/L HCl:见 A. 7。

4.8   大肠菌群计数测试片(应以发酵乳糖产酸产气为阳性结果判断依据,且性能符合GB 4789.28中相关培养基的质量要求)。

第一法  大肠菌群 MPN计数法

5   检验程序

大肠菌群 MPN计数法的检验程序见图 1 。

图 1   大肠菌群 MPN计数法检验程序

6   操作步骤

6.1   样品的稀释

6.1.1   固体和半固体样品:无菌操作称取25 g样品,放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000 r/min~10000 r/min均质1 min~2 min;或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1 min~2 min,制成1∶10的样品匀液。

6.1.2   液体样品:用无菌吸管吸取25 mL样品置于盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中充分混匀,或放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1 min~2 min,制成1∶10的样品匀液。当样品不适宜进行体积取样时,按6.1.1操作。

6.1.3   必要时用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl,调节样品匀液或液体样品原液的pH至6.5~7.5之间。

6.1.4   用无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1 mL,沿管壁缓缓注入装有9 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),将试管在振荡器上振荡混匀,制成1∶100的样品匀液。

6.1.5   根据对样品污染状况的估计,参照6.1.4的操作,依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支无菌吸管或吸头。

6.2   初发酵试验

每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管LST肉汤,每管LST肉汤接种1 mL样品匀液(如接种体积超过1 mL,则加到等体积的双料LST肉汤中)。从制备样品匀液开始至接种到LST肉汤完毕,全过程不得超过15min。将已接种样品的LST肉汤管置于36℃±1℃培养24h±2h,检查产气情况。小倒管或产气收集装置内有气泡产生,或轻轻振摇LST肉汤管可见试管内有细密气泡不断上升者,判断为产气,产气者进行复发酵试验(确认试验)。如未产气则继续培养至48h±2h再检查产气情况,产气者进行复发酵试验;培养至48 h±2 h,仍未产气者判断为大肠菌群阴性。若培养至48h±2h,所有LST肉汤管均未产气,按照附录B中的MPN检索表,报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值,以MPN/g(mL)表示。

6.3   复发酵试验(确认试验)

轻轻振摇各产气的LST肉汤管,分别用接种环取培养物1环,转种于BGLB肉汤管中,36℃±1℃培养24h±2h,检查产气情况,产气者判断为大肠菌群阳性;未产气者则继续培养至48 h±2h再检查产气情况,产气者判断为大肠菌群阳性,仍未产气者判断为大肠菌群阴性。

7   结果与报告

根据复发酵试验中3个适宜连续稀释度中大肠菌群阳性的管数(如连续的稀释度超过3个,根据附录C确定最适的3个连续稀释度),按照附录B中的MPN检索表,报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值,以MPN/g(mL)表示。

第二法  大肠菌群平板计数法

8   检验程序

大肠菌群平板计数法的检验程序见图 2。

图 2   大肠菌群平板计数法检验程序

9   操作步骤

9.1   样品的稀释

按 6. 1进行 。

9.2   接种与培养

9.2.1   根据对样品污染状况的估计,选取2个~3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种2个无菌培养皿,每皿1 mL。同时取磷酸盐缓冲液或生理盐水加入2个无菌培养皿作空白对照,每皿1 mL。

9.2.2  尽快将冷却至48℃±2℃的VRBA倾注于培养皿中,每皿15 mL~20 mL。小心旋转培养皿,将培养基与接种的样品匀液充分混匀,水平静置待其凝固。从制备样品匀液开始至倾注VRBA完毕,全过程不得超过15 min。琼脂凝固后,再均匀覆盖3 mL~4 mL VRBA至整个平板表面。覆层的琼脂凝固后翻转平板,置于36℃±1℃培养18h~24h。对于乳及乳制品,应置于30℃±1℃培养18h~24h。

9.2.3   若采用大肠菌群计数测试片,则按其说明进行操作。

9.3   平板菌落数的选择

9.3.1   观察并计数菌落,必要时用放大镜或菌落计数器。选取所有菌落数在15 CFU~150 CFU之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为红色至紫红色,菌落周围可带有红色沉淀环,菌落直径一般大于0.5 mm。可疑菌落为红色至紫红色,菌落直径一般小于0.5 mm。

9.3.2   若有2个稀释度的平板菌落数在15 CFU~150 CFU之间以及其他情形的菌落数选择,按附录D的规定执行。

9.4   确认试验

从同一稀释度的VRBA平板上挑取典型和可疑菌落各5个,典型或可疑菌落少于5个者,则挑取其全部菌落。每个菌落接种1支BGLB肉汤管,36℃±1℃培养24h±2h,检查产气情况,产气者为大肠菌群阳性;未产气者则继续培养至48h±2 h再观察,产气者为大肠菌群阳性,仍未产气者为大肠菌群阴性。

10   结果与报告

10.1   所选稀释度的典型菌落数以及可疑菌落数与各自大肠菌群阳性率的乘积之和的平均值,乘以稀释倍数,为大肠菌群的菌落数。大肠菌群的菌落数小于100CFU时,按“四舍五入”的原则修约,以整数报告。大肠菌群的菌落数大于或等于100CFU时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,保留两位有效数字。附录D规定了大肠菌群菌落数的计算、数值修约和结果报告的方式,并给出了相关示例。

10.2   若空白对照上有菌落生长,则此次检验结果无效。

10.3   称重取样以CFU/g为单位报告结果,体积取样以CFU/mL为单位报告结果。