GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数 
前 言
本标准代替 GB4789.3—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》、GB/T47893.2—2002《食品卫生微生物学检验 大肠菌群的快速检测》和SN/T0169—2010《进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法》大肠菌群计数部分。
本标准与GB47893.—2010相比,主要变化如下:
———增加了检验原理;
———修改了适用范围;
———修改了典型菌落的形态描述;
———修改了第二法平板菌落数的选择;
———修改了第二法证实试验;
———修改了第二法平板计数的报告。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 大肠菌群计数
1 范围
本标准规定了食品中大肠菌群(Coliforms)计数的方法。
本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数;第二法适用于大肠菌群含量较
高的食品中大肠菌群的计数。
2 术语和定义
2.1
大肠菌群 Coliforms
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2
最可能数 Mostprobablenumber;MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法。
3 检验原理
3.1 MPN 法
MPN 法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
3.2 平板计数法
大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带有沉淀环的菌落。
4 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
4.1 恒温培养箱:36℃ ±1℃。
4.2 冰箱:2℃~5℃。
4.3 恒温水浴箱:46℃±1℃。
4.4 天平:感量g。
4.5 均质器。
4.6 振荡器。
4.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
4.8 无菌锥形瓶:容量500mL。
4.9 无菌培养皿:直径90mm。
4.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
4.11 菌落计数器。
5 培养基和试剂
5.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(laurylsulfatetryptose,LST)肉汤:见A.1。
5.2 煌绿乳糖胆盐(brilliantgreenlactosebile,BGLB)肉汤:见A.2。
5.3 结晶紫中性红胆盐琼脂(violetredbileagar,VRBA):见A.3。
5.4 无菌磷酸盐缓冲液:见 A.4。
5.5 无菌生理盐水:见 5。
5.6 1mol/LNaOH溶液:见A.6。
5.7 1mol/LHCl溶液:见A.7。
第一法 大肠菌群 MPN 计数法
6 检验程序
大肠菌群 MPN 计数的检验程序见图1。
图1 大肠菌群 MPN 计数法检验程序
7 操作步骤
7.1 样品的稀释
7.1.1 固体和半固体样品:称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内 ,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。
7.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。
7.1.3 样品匀液的pH应在65.~7.之间,必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。
7.1.4 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。
7.1.5 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。
7.2 初发酵试验
每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤),36℃± 1℃ 培养24h±2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h±2h产气者进行复发酵试验(证实试验),如未产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
7.3 复发酵试验(证实试验)
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1 环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中, 36℃±1℃培养48h±2h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。
7.4 大肠菌群最可能数(MPN)的报告
按73.确证的大肠菌群BGLB阳性管数,检索 MPN表(见附录B),报告每g(mL)样品中大肠菌群的 MPN值。
第二法 大肠菌群平板计数法
8 检验程序
大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。
图2 大肠菌群平板计数法检验程序
9 操作步骤
9.1 样品的稀释按71.进行。
9.2 平板计数
9.2.1 选取2个~3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
9.2.2 及时将15mL~20mL融化并恒温至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3mL~4mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平板,置于36℃±1℃培养18h~24h。
9.3 平板菌落数的选择
选取菌落数在15CFU~150CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落(如菌落直径较典型菌落小)。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm或更大,最低稀释度平板低于15CFU 的记录具体菌落数。
9.4 证实试验
从 VRBA 平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于BGLB肉汤管内,36℃±1℃培养24h~48h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。
9.5 大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以9.3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g(mL)样品中大肠菌群数。例:10-4样品稀释液1mL,在 VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×104/g(mL)= 6.0×105CFU/g(mL)。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
附 录 A培养基和试剂
A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤
A.1.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨
氯化钠乳糖
磷酸氢二钾(K2HPO4)磷酸二氢钾(KH2PO4)月桂基硫酸钠
蒸馏水
20.0g
5.0g
5.0g
2.75g
2.75g
0.1g 1000mL
A.1.2 .制法
将上述成分溶解于蒸馏水中,调节pH 至68.±02.。分装到有玻璃小倒管的试管中,每管10mL。121℃高压灭菌15min。
A.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤
A.2.1 成分
蛋白胨乳糖
牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液01.%煌绿水溶液
蒸馏水
10.0g
10.0g 200mL
13.3mL 800mL
A.2.2 制法
将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL( 20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中,调节pH至70.~75.),用蒸馏水稀释到975mL,调节pH 至72.±01.,再加入01.%
煌绿水溶液133.mL,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的试管中,每管10mL。121℃高压灭菌15min。
A3 .结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)
A3.1 .成分
蛋白胨酵母膏乳糖
7.0g
3.0g
10.0g
氯化钠
胆盐或3号胆盐中性红
结晶紫琼脂
蒸馏水
5.0g
1.5g
0.03g 0.002g 15g~18g 1000mL
A3.2 .制法
将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调节pH 至74.±01.。煮沸2min,将培养基融
化并恒温至45℃~50℃倾注平板。使用前临时制备,不得超过3h。
A4 .磷酸盐缓冲液
A4.1 .成分
磷酸二氢钾(KH2PO4)蒸馏水
34.0g 500mL
A4.2 .制法
贮存液:称取340.g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中,用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH 至72.±02.,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液:取贮存液12.5mL,用蒸馏水稀释至1000mL,分装于适宜容器中,121℃高压灭菌15min。
A5 .无菌生理盐水
A5.1 .成分
氯化钠蒸馏水
8.5g 1000mL
A5.2 .制法
称取85.g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。
A6 .1mol/LNaOH 溶液
A6.1 .成分
NaOH蒸馏水
40.0g 1000mL
A6.2 .制法
称取40g氢氧化钠溶于1000mL无菌蒸馏水中。
A7 .1mol/LHCl溶液A7.1 .成分
HCl蒸馏水
90mL 1000mL
A7.2 .制法
移取浓盐酸90mL,用无菌蒸馏水稀释至1000mL。
附 录 B
大肠菌群最可能数(MPN)检索表
B1 .大肠菌群最可能数(MPN)检索表
每g(mL)检样中大肠菌群最可能数(MPN)的检索见表B1.。
表 B1 .大肠菌群最可能数(MPN)检索表
|
阳性管数 |
MPN |
95%可信限 |
阳性管数 |
MPN |
95%可信限 |
||||||
|
0.10 |
0.01 |
0.001 |
下限 |
上限 |
0.10 |
0.01 |
0.001 |
下限 |
上限 |
||
|
0 |
0 |
0 |
<3.0 |
— |
9.5 |
2 |
2 |
0 |
21 |
4.5 |
42 |
|
0 |
0 |
1 |
3.0 |
0.15 |
9.6 |
2 |
2 |
1 |
28 |
8.7 |
94 |
|
0 |
1 |
0 |
3.0 |
0.15 |
11 |
2 |
2 |
2 |
35 |
8.7 |
94 |
|
0 |
1 |
1 |
6.1 |
1.2 |
18 |
2 |
3 |
0 |
29 |
8.7 |
94 |
|
0 |
2 |
0 |
6.2 |
1.2 |
18 |
2 |
3 |
1 |
36 |
8.7 |
94 |
|
0 |
3 |
0 |
9.4 |
3.6 |
38 |
3 |
0 |
0 |
23 |
4.6 |
94 |
|
1 |
0 |
0 |
3.6 |
0.17 |
18 |
3 |
0 |
1 |
38 |
8.7 |
110 |
|
1 |
0 |
1 |
7.2 |
1.3 |
18 |
3 |
0 |
2 |
64 |
17 |
180 |
|
1 |
0 |
2 |
11 |
3.6 |
38 |
3 |
1 |
0 |
43 |
9 |
180 |
|
1 |
1 |
0 |
7.4 |
1.3 |
20 |
3 |
1 |
1 |
75 |
17 |
200 |
|
1 |
1 |
1 |
11 |
3.6 |
38 |
3 |
1 |
2 |
120 |
37 |
420 |
|
1 |
2 |
0 |
11 |
3.6 |
42 |
3 |
1 |
3 |
160 |
40 |
420 |
|
1 |
2 |
1 |
15 |
4.5 |
42 |
3 |
2 |
0 |
93 |
18 |
420 |
|
1 |
3 |
0 |
16 |
4.5 |
42 |
3 |
2 |
1 |
150 |
37 |
420 |
|
2 |
0 |
0 |
9.2 |
1.4 |
38 |
3 |
2 |
2 |
210 |
40 |
430 |
|
2 |
0 |
1 |
14 |
3.6 |
42 |
3 |
2 |
3 |
290 |
90 |
1000 |
|
2 |
0 |
2 |
20 |
4.5 |
42 |
3 |
3 |
0 |
240 |
42 |
1000 |
|
2 |
1 |
0 |
15 |
3.7 |
42 |
3 |
3 |
1 |
460 |
90 |
2000 |
|
2 |
1 |
1 |
20 |
4.5 |
42 |
3 |
3 |
2 |
1100 |
180 |
4100 |
|
2 |
1 |
2 |
27 |
8.7 |
94 |
3 |
3 |
3 |
>1100 |
420 |
— |
|
注1:本表采用3个稀释度[01.g(mL)、00.1g(mL)、00.01g(mL)],每个稀释度接种3管。 注2:表内所列检样量如改用1g(mL)、0. 和00.1g(mL)时,表内数字应相应降低10倍;如改用0.01g (mL)、00.01g(mL)和00.001g(mL)时,则表内数字应相应增高10倍,其余类推。 |
|||||||||||
